УДК: [579.087.9+543.95] + 543.86

Ю.Н. Власов, д-р техн. наук, А.А. Мазничко, канд. техн. наук, В.В. Зоря, А.Н. Решетилов, д-р хим. наук, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино

ПРИМЕНЕНИЕ БИОСЕНСОРНЫХ МЕТОДОВ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ПОРАЖАЮЩИХ ФАКТОРОВ ХИМИЧЕСКОЙ И БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ

Обычно практическое применение биосенсоров рассматривается преимущественно в гражданских областях – биотехнологии, пищевой промышленности, медицине, экологии. Ряд задач, относящихся к оповещению о биологической и химической опасности в условиях войсковой обстановки, также может быть решен с использованием биосенсорного анализа. В статье затронуты некоторые вопросы использования биосенсорных методов обнаружения биологически активных соединений войскового применения, в том числе детекция патогенных микроорганизмов.

Биосенсоры для обнаружения химических и биологических факторов

Биосенсоры для детекции микроорганизмов

Биосенсоры и аналитические процедуры на их основе уже давно вышли за рамки лабораторных исследований и заняли устойчивую нишу в повседневной практике. Биотехнология, пищевая промышленность, медицина, экология – далеко не полный перечень возможных областей их применения в гражданских целях. Ряд причин приводит к растущему интересу военных и силовых ведомств многих стран к практическому использованию биосенсорной аналитики в целях национальной безопасности, поскольку учащаются террористические акты с применением отравляющих веществ (ОВ) и не исключена возможность применения террористами биологического оружия (БО) [1]. Угроза применения химического и биологического оружия приводит к необходимости создания методов и приборов для выполнения не только быстрого и высокочувствительного обнаружения поражающих воздействий, но и предупреждающего контроля. Использование биосенсоров для создания систем высокочувствительной и селективной детекции ОВ и БО и предотвращения последствий их применения относится к перспективным направлениям в разработке мер воинской химической и биологической защиты.

Рассматривая вопрос о возможном практическом применении биосенсоров в воинской практике отметим, что в данной работе в соответствии с классической терминологией под “биосенсором” подразумевается компактное устройство/прибор, содержащий анализирующий элемент биологической природы (биорецептор), работа которого может быть основана на использовании ферментов, клеток, антител, клеточных рецепторов и т.д. и который сопряжен с физическим преобразователем, проводящим регистрацию сигналов биологического элемента.

Потенциально биосенсоры способны выполнять чувствительную и специфическую детекцию вредных воздействий, что обусловливает в целом перспективность развития данного направления. Анализ различных методов детекции, параметров и типов описанных биосенсоров и возможности их использования в войсковой практике приведены в обзоре [2]. Целесообразность использования в войсковой практике биосенсорных датчиков обусловлена следующими соображениями:

· имеется возможность разрабатывать системы для раннего предупреждения о применении химического или биологического оружия;

· биосенсоры для обнаружения биологического и химического оружия могут быть основаны на ферментах, антителах и тканевом материале, что позволяет имитировать сложные функции многоклеточных человеческих органов и с высокой чувствительностью оценивать поражающее действие;

· достоинствам биосенсорного анализа относится возможность выявления не только известных, но и не использовавшихся ранее веществ;

· биосенсоры позволяют отличать физиологически активные вещества от неактивных химических соединений;

· малогабаритность и компактность анализаторов.

Характеризуя биосенсор как анализирующую систему, кратко отметим основные функции биоматериала. Биологический материал может быть сопряжен с преобразователями различных типов, которые обеспечивают наиболее эффективную регистрацию сигналов при взаимодействии с анализируемым соединением.

В биосенсорах электрохимического типа в сочетании с потенциометрическими электродами применяют ферменты, рецепторы, клетки микроорганизмов, ткани растений и животных, антитела, меченые ферментами. В сочетании с амперометрическими электродами известно использование ферментов, микроорганизмов, тканей растений и животных, антител, меченых ферментами.

В биосенсорах кондуктометрического типа описано использование ферментов, искусственных бислойных липидных мембран.

Оптические типы биосенсоров основаны на измерении флюоресценции, люминесценции, эффектов поверхностного плазменного резонанса, затухающих волн.

В биосенсорах на основе акустических преобразователей известно применение антител, антигенов, ферментов, нуклеиновых кислот.

Измерение количества теплоты, выделяемой при взаимодействии анализируемого соединения с материалом биорецептора, используется в биосенсорах калориметрического типа; основой биорецептора могут служить ферменты, клетки микроорганизмов, животных. Для дальнейшего знакомства с биосенсорами различных типов можно обратиться к монографиям [3-5].

Биорецептор сенсора выполняет селективное распознавание анализируемого соединения, и кроме того, отвечает за возникновение сигнала физико-химической природы, который регистрируется преобразователем. Биорецепторы можно разделить на две категории: каталитические и аффинные. Группа каталитических биорецепторов включает ферменты, ткани, клетки микроорганизмов. Сенсоры, основанные на этих компонентах, позволяют проводить анализ в непрерывном режиме; типичный диапазон измеряемых концентраций заключен в пределах от микро- до миллимолей. К группе некаталитических (аффинных) относятся биосенсоры на основе антител/антигенов, лектинов, клеточных рецепторов, нуклеиновых кислот, которые в большинстве случаев предназначены для одноразового использования при детекции гормонов, стероидов, лекарственных веществ в концентрациях от пико- до микромолей.

Ферменты. Стабильность фермента является, как правило, решающим фактором, определяющим время жизни сенсора; продолжительность непрерывного функционирования может составлять от одного дня до одного или двух месяцев.

Органеллы. Митохондрии, хлоропласты, целые клетки – бактерии, микроскопические грибы, а также срезы тканей растительного или животного происхождения используют в сенсорах как структуры, содержащие наборы ферментов. Основной недостаток биосенсоров этого типа – низкая селективность.

Клеточные рецепторы. Рецепторы животных клеток относятся к белкам, локализованным в мембранах и не обладающим каталитической активностью. Связывание анализируемого соединения с иммобилизованными рецепторами может быть измерено непосредственно пьезоэлектрическим преобразователем по изменению массы биоэлемента либо с помощью оптической техники на установках по измерению поверхностного плазменного резонанса.

Антитела (Am) и антигены (Аг). Образование комплекса Аг с Ат преобразователем биосенсора может быть измерено непосредственно или косвенно. Непосредственно можно зарегистрировать изменения массы с помощью акустического преобразователя, а также изменение угла отражения методом поверхностного плазменного резонанса. Связывание также может быть зарегистрировано техникой, основанной на использовании оптических методов, в случае, если Аг или Ат конъюгировано с флюоресцентной меткой; в биосенсорах электрохимического типа для проявления комплекса антиген/антитело применяют ферментную метку.

Два последних типа биосенсоров относятся к классу иммуносенсоров с косвенной детекцией.

Нуклеиновые кислоты. Последнее десятилетие отмечено интенсивным развитием методов электрохимической, микрогравиметрической и оптической детекции реакций гибридизации ДНК, а также использования ДНК как мишени воздействия [6]. В ряде работ было показано, что электрохимические методы не обладают высокой чувствительностью и помехоустойчивостью, поэтому наиболее приемлемыми оказались акустический и оптический методы [7].

Биосенсоры для обнаружения химических и биологических факторов

Расширенный список материалов, которые рассматриваются как токсичные и относятся к потенциальным препаратам для применения в качестве ОБ и БО приведен в [8] (цитирование по [2]). Биосенсоры, предназначенные для детекции токсичных материалов, условно можно разделить на три группы: для обнаружения токсичных химикатов, токсинов, микроорганизмов.

В список химических соединений, для которых в настоящее время разработаны методы биосенсорной детекции, входят паратион, малатион, этилпаратион, диизопропилфторфосфат, зоман, параоксон, фосфорорганические соединения типа диметил-метил-фосфоната, используемые как модели боевых нервно-паралитических ОВ, цианид; описаны биосенсоры для детекции таких токсинов как a-бунгаротоксин, токсин яда гремучих змей (mojave toxin), охра-токсин (микотоксин Aspergillus ochraceus), ботулинический токсин тип А, энтеротоксин стафилококка, рицин [2].

К поражающим агентам биологического оружия относятся живые организмы, включая вирусы или инфекционный материал, полученный от них и вызывающий болезни, гибель людей, животных, растений. Патогенные бактерии синтезируют и выделяют во внешнюю среду экзотоксины, являющиеся причиной патологических состояний. Примерами таких ядов, которые отравляют или убивают клетки млекопитающих, являются токсин Shigella dysenteriae, энтеротоксин золотистого стафиллококка, столбнячный токсин, ботулинический токсин, а также токсины, продуцируемые бактериями Bacillus anthracis и Coryne-bacterium diphtheriae. Другие патогенные бактерии (Salmonella и Brucella) выделяют токсины при лизисе; эти токсины являются компонентами клеточной стенки, представляют собой конъюгаты белков, липидов и углеводов и носят название эндотоксинов.

Некоторые грибы патогенны для человека в связи с тем, что могут проникать и размножаться в тканях; в этом случае повреждающий эффект не связан с выделением токсинов. Другие грибы (в основном Fusarium, Penicillium, Aspergillus), являющиеся контами-нантами продуктов и кормов, представляют серьезную опасность в связи с их способностью синтезировать крайне токсичные соединения – микотоксины. К ним в первую очередь следует отнести афлатоксины, охра-токсины, трихотеценовые соединения, патулин, эргоалкалоиды и ряд других [9].

Биосенсоры для детекции микроорганизмов

Как правило, все микроорганизмы являются иммуногенами. В этой связи для их детекции существуют или могут быть созданы методы анализа, основанные на стандартных подходах иммуноферментного анализа и адаптированные к биосенсорной технике измерения. Некоторые микроорганизмы, обнаруживаемые с помощью биосенсорных методов, представлены в таблице 1 далее следует их краткий анализ.

Таблица 1. Микроорганизмы, обнаруживаемые с помощью биосенсорных методов

Тип организмов	Тип биосенсора, преобразователя	Предел детекции	*Среда*	*Время анализа*	*Литература*
Nesseria meningitidis	LAPS (антиген/антитела, ПХ)	< 1000 клеток	Водная среда	20 мин	[10]
Yersinia pestis		< 1000 клеток		30 мин
Yersinia pestis	Акустический преобразователь, антитела	10⁶ клеток	Водная среда	45 мин	[22]
Shigella dysenteriae		10⁶ клеток
Yersinia pestis	Оптические волокна, флюоресцентная метка	5 нг/мл	Водная среда	30 мин	[18]
Brucella militensis	LAPS, антитела, уреаза	6000 клеток	Водная среда	-	[11,14]
Newcastle desease virus	Оптическое волокно, затухающая волна	5нг	Водная среда	15 мин	[14]
Francisella tularensis	LAPS, антитела, уреаза	3,8 нг (5100 леток)	Водная среда	65 мин	[15]
Salmonella typhimurium	Акустические антитела	10⁵ клеток/мл	Водная среда	5 ч	[21]
Salmonella typhimurium	Акустический (ДНК)	1 мг/мл	Водная среда	-	[28]
Salmonella typhimurium	Оптические, люминесценция, антитела	10⁵ клеток/мл	Водная среда	30 мин	[20]
Bacillus athracis (споры)	Оптический (затухающая волна)	3×10³клеток/мл	Водная среда	35с	[19]
Обозначения: LAPS – светоадресуемый потенциометрический сенсор, ПХ – пероксидаза хрена.

В работе [10] описана возможность использования СПС-преобразователя (светоадресуемого потенциометрического сенсора) для детекции бактериальных антигенов в целом. Процедуру разрабатывали для обнаружения патогенных бактерий Neisseria meningitidis и Yersinia pestis. Показана высокая чувствительность созданной системы – метод позволял детектировать наличие в пробе 1000 бактериальных клеток, время анализа составляло 20 мин, в то время как стандартный метод иммуноферментного анализа позволяет обнаруживать только 60000 клеток за время 2,5 ч. СПС являлся также основой биосенсоров для детекции бактерий Brucella militensis [11], Francisella tularensis [12], Coxiella burnetti [13] и вируса Ньюкасловской лихорадки (NDV) [11,14]. Для бактерий Brucella нижний предел детекции составлял 6 нг (6000 клеток), для NDV 1,3-40 нг. Метод, предложенный Томпсон и Ли [15], позволял обнаруживать 3400 клеток (около 4 нг) при времени инкубации 1 ч.

Определение концентрации клеток Clostridium thermocellum представлено в работе [6]; авторы использовали поликлональные антитела к С. thermocellum. Надежную регистрацию обеспечивал метод предварительной сорбции клеток на активированную поверхность полимерной мембраны и дальнейшее проявление клеток антителами и белком А, конъюгированным с пероксидазой хрена; минимальная детектируемая концентрация клеток составляла 10⁴ клеток/мл, максимальная исследованная – 10⁷ клеток/мл.

Исследования по иммунодетекции интенсивно ведутся для преобразователей оптического и пьезоэлектрического типов. Описана оптическая система на основе поликлональных антител для детекции вируса NDV, в которой использован принцип регистрации затухающих волн [17]. В работе [18] использовали флюороиммуносенсор для детекции Yersinia pestis; метод позволял обнаруживать 5 мг/мл бактерий за время 30 мин. Приближенная оценка концентрации, превышающей 50 мг/мл, могла быть получена за 15 мин. Применяя такую же схему детекции, в работе [19] показали, что используя антитела к защитному белку (РА), выделяемому бактериями одновременно с сибиреязвенными токсинами, можно эффективно применять сенсор в медицинских диагностических целях с нижним пределом детекции для РА 10 нг/мл. Оптический иммуносенсор с ферментной меткой (пероксидаза хрена), генерирующей хемилюминесцентный сигнал, для детекции Salmonella typhimurium приведен в [20]; нижний предел детекции составлял 10⁵ клеток/мл.

Биосенсор на основе пьезоэлектрического кристалла использовали для детекции Salmonella typhimurium [21]. Исследованный диапазон концентраций клеток составлял 10⁵-10⁹ клеток/мл. Время измерения зависело от концентрации клеток; при концентрации 10⁵ клеток/мл для измерения требовалось 5 ч. Аналогичное устройство применили для обнаружения Yersinia pestis и Shigella dysenteriae [22]; линейную зависимость сигнала наблюдали для диапазона 10⁶-10⁸ клеток. Сенсор позволял выполнить 12 анализов без заметной потери чувствительности в течение 6 недель при хранении в сухом состоянии. Теоретические аспекты применения стандартной сэндвич-схемы иммуноферментного анализа с последующей проверкой результатов на экспериментальных моделях детекции бактериальных клеток рассмотрены в работе [23].

Кроме описанных выше методов иммунодетекции микроорганизмов перспективным направлением является разработка биосенсорных методов обнаружения микроорганизмов на основе регистрации их оксидоредуктазной и дегидрогеназной активности. Рецепторным элементом биосенсора в этом случае будет являться носитель, содержащий собранные из окружающей среды микроорганизмы; предполагается, что преобладание в пробе какого-либо определенного вида (штамма) может быть идентифицировано по характерному “портрету” субстратной специфичности, представляющему соотношение значений активностей каталитических систем клеток при окислении различных тестовых субстратов [24-26].

Принципиально новым подходом в детекции и идентификации микроорганизмов является разработка ДНК-биосенсоров. Анализ, основанный на гибридизации нуклеиновых кислот, представляет альтернативную иммуноанализу процедуру обнаружения; сопряженный с тиражированием искомого материала с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), он обеспечивает наивысший уровень чувствительности [27]. В соответствии с этим принципом описан микрогравиметрический сенсор, который применили для детекции Salmonella typhimurium с помощью ДНК-зонда, иммобилизованного на поверхности кварцевого кристалла [28]. Перспективность детекции микроорганизмов с помощью ДНК-сенсора была показана также для преобразователей оптического и электрохимического типов. Так, процесс гибридизации олигонуклеотидов регистрировали оптическим путем, используя метод поверхностного плазменного резонанса [29], а также метод регистрации затухающих волн [30]. В последнем случае сенсор позволял обнаруживать 1 мг олигонуклеотида, содержащего 20 оснований за время 60 с. Авторы показали, что рецептор можно регенерировать, подогревая его до 363 К, поэтому зонд позволял проводить измерения многократно.

Описан прототип биосенсора, позволяющий определять специфические последовательности ДНК и основанный на измерении значений пикового тока, генерируемого индикаторами гибридизации [31]. Сенсор позволял выполнить до 10 циклов регенерации. Разработан метод для измерения общего содержания ДНК микробных клеток [32]; для этого меченный биотипом белок Е. coli, связывающий одноцепочечную ДНК и антитела к ДНК, конъюгированные с уреа-ой, инкубировали в присутствии стрептавидина с образцами ДНК, подвергнутыми тепловой обработке. Активность уреазы измеряли с помощью СПС. Сигналы сенсора были пропорциональны концентрации ДНК в диапазоне 2-200 пикограмм (пг). Общее время анализа не превышало 2 ч при нижнем пределе детекции 2 пг.

Значительная часть собранных к настоящему времени данных не говорит о возможности сиюминутного использования ферментов, рецепторов или иммуноактивных компонентов в биосенсорах для непрерывного мониторинга токсичных материалов. В первую очередь это связано с относительно низкой стабильностью биологического материала, необратимостью процесса связывания анализируемого соединения с рецепторным элементом сенсора и необходимостью вносить новые порции субстратных смесей в случае регистрации, производимой сенсорами типа СПС или оптическими. Кроме того, с точки зрения оперативности оценок, необходимой для анализа в полевых условиях, оценка поражающих агентов с помощью иммуно- и ДНК-сенсоров и процедура детекции являются слишком длительными. Вместе с тем, несмотря на перечисленные проблемы, биосенсоры представляют собой высокоэффективный инструмент анализа и позволяют выполнять высокочувствительную детекцию “на месте” поражающих агентов химической и биологической природы. Дальнейшие исследования в этом направлении позволят расширить возможности данного типа анализаторов и приблизиться к созданию непрерывно действующих, необслуживаемых систем анализа.

Список литературы

1. Золотов Ю.А. Химическое оружие: аналитический аспект // Журнал аналитической химии, 1998, т. 53, № 6. С. 565.

2. Paddle В.М. Biosensors for chemical and biological agents of defense inferest // Review article. Резюме. Biosensors and Bioelectronics, 1996, v. 11, № 11. P. 1079-1113.

3. Gabor Harsanyi. Sensors in Biomedical Applications; Fundamentals: Technology & Applications. Technomic Publishing Company, 2000. 576 p.

4. Donald G. Buerk. Biosensors: Theory and Applications. Technomic Publishing Company. 1993, 673 p.

5. Тернер Э., Карубе И. Биосенсоры: основы и приложения. М.: Мир, 1992. 770 с.

6. Евдокимов Ю.М. Биосенсоры на основе одно- и двухцепочечных линейных молекул ДНК // Сенсорные системы. 1998, т. 12, № 1. С. 5-21.

7. Евдокимов Ю.М., Скуридин С.Г., Салянов В.И., Рыбин В.К. и др. Принципы создания биодатчиков на основе жидких кристаллов нуклеиновых кислот // Биофизика. 1990, т. 39, № 5. С. 731-738.

8. Gessler E. (ed.) Biological and Toxin Weapons Today. Oxford University Press for SIPRI, 1986.

9. Тутельян В.А., Кравченко Л.Г. Микотоксины. М.: Медицина. 1985. 420 с.

10. Libby J.M., Wada H.G. Detection of Nesseria meningitidis and Yersinia pestis with a novel silicon-based sensor/ / J. Clin. Microbiol. 1989, № 27. P. 1456-1459.

11. Lee W.E., Jacobson T.V. & Thompson H.G. Characteristics of the biochemical detector sensor // Defence Research Establishment Suffield, Canada. Suffield Memorandum, 1993, № 1402. P. 1-23.

12. Lee W.E. & Hall L.G. et al. Biosensor based detection of soman // Deference Research Establishment Suffield, Canada Suffield Memorandum 1992, № 1380. P. 1-14.

13. Menking D.G., Goode M.T. Evalution of cocktailed antibodies for toxin and pathogen assays on the light addressable potentiometric sensor // In: ERDEC Scientific Conference on Chemical Defense Research, 17-20 November Proc. 1992 ERDEC Scientific Conference on Chemical Defense Research, 17-20 November, J.D. Williams, D.A. Berg & Reeves (eds.) Report No. ER-DES-SP-007, June 1993. P. 103-109.

14. Lee W.E., Thompson H.G., Hall J.G. Rapid immunofiltration assay of Newcastle Disease Virus using a silicon sensor // J. Im-munol. Meth., 1993, № 166. P. 123-131.

15. Thompson H.G., Lee W.E. Rapid immunofiltration assay of Francisella tularensis // Defence Research Establishment Suffield. Canada. Suffield Memorandum. 1992, № 1376. P. 1-17.

16. Akimenko V.K., Khomutov S.M., Obraztsova A.Ya., Reshetilov A.N. et al. A Rapid Method for Detection of Clostridium thermocellum by field-effect transistor-based immunodetection // J. Microbiological Methods. 1996. v. 24. P. 203-209.

17. Lee W.E., Thompson H.G. Fibre optic biosensor assay of Newcastle Disease Virus // Defense Research Establishment Suffield, Canada. Suffield Report. 1993, № 580. P. 1-36.

18. Cao K.L., Andersen G.P., Ligler F.S. & Ezzell J. Detection of Yersinia pestis Fraction I antigen with a fiber optic biosensor // J. Clin. Microbiol., 1995, № 33. P. 336-341.

19. Wijesuriya D., Anderson G.P. & Ligler F.S. A rapid and sensitive immunoassay for bacteria cells // Proc. 1993 ERDEC Scientific Conference on Chemical Defense Research 16–19 November, Berg D. A., Williams J. D. Jr. & P. J. Reeves (eds.). Report No. ERDES-SP-024, August, 1994. P. 671-677.

20. Starodub N.F., Arenkov P.Y., Starodub A.N. & Berezin V.A. Construction and biomedical application of immunosensors based on fiber optics and enhanced chemiluminescence // Opt. Eng., 1994, № 33. P. 2958-2963.

21. Prusak-Sochaczewski E., Luong J.H. T. & Guilbault G.G. Development of a piezoelectric immunosensor for the detection of Salmonella typhimurium // Enzyme Microbial. Technol., 1990, № 12. P. 173-177.

22. Konig B. & Gratzel M. Detection of viruses and bacteria with piezoelectric immunosensors // Anal. Lett., 1993, № 26. P. 1567-1585.

23. Карулин А.Ю., Дзантиев Б.Б. Поливалентное взаимодействие антиген-антитело: теоретические модели и роль в иммуноанализе клеток // Журнал Всесоюзного химического общества им. Менделеева. 1989, т. 34, № 1. С. 30-38.

24. Луста К.А., Решетилов А.Н. Физиолого-биохимические особенности Gluconobacter oxydans и перспективы использования в биотехнологии и биосенсорных системах // Прикладная биохимия и микробиология. 1998, т. 34, № 4. С. 339-353.

25. Ильясов П.В., Шмалько Т.А., Луста К.А., Решетилов А.Н. Сравнительная оценка свойств бактерий рода Gluconobacter для биосенсорной детекции органических субстратов // Прикладная биохимия и микробиология. 1998, т. 34, № 5. С. 529-533.

26. Reshetilov A.N., Iliasov P.V., Filonov A.E., Gayazov R.R. et al. Pseudomonas putida as a receptor element of microbiol sensor for naphthalene detection // Process Biochemistry. 1997, v. 32, № 6. P. 487-493.

27. Smith T.J., Dawson M.T. & Gannon F. The 16S23S ribosomal RNA spacer region as a target for DNA probes to identify potential biological warfare threats // Proc. 1993 ERDES ERDEC Scientific Conference on Chemical Defense Research 16-19 November, Berg D.A Williams J.D., Jr. & P.J. Reeves (eds.). Report No. ERDES-SP-0 24, August, 1994. P. 603-608.

28. Downs M.E. A. Prospects for nucleic acid biosensors // Biochem. Soc. Trans., 1991 № 19 39-43. Enzyme Nomenclature 1978. (1979). Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry. Academic Press, New York.

29. Pollard-Knight D., Hawkins E., Yeung D., Pashby D.P. et al. Immunoassays and nucleic acid detection with a biosensor based on surface plasmon resonance // Ann. Biol. Clin. 1990, № 48. P. 642-646.

30. Graham C.R., Leslie D. & Squirrell D.J. Gene probe assays on a fibre-optic evanescent wave biosensor // Biosensors & Bio-electronics. 1992, № 7. P. 487-493.

31. Millan K.M., Mikkelson S.R. Sequence selective biosensor for DNA based on electroactive hybridization indicators // Anal. Chem., 1993, № 65. P. 2317-2323.

32. Rung V.Т., Panffli P.R., Sheldon E.L., King R.S. et al. Picogram quantiation of total DNA using DNA-binding proteins in a silicon sensor-based system // Anal. Biochem., 1990, № 187. P. 220-227.

Наверх